Le thème central du poème est le passage douloureux mais nécessaire par une "nuit obscure" pour atteindre l'union divine. Cette obscurité symbolise les épreuves, les doutes et le sentiment de séparation d'avec Dieu que traverse l'âme en quête d'illumination. Jean de la Croix décrit avec puissance les difficultés de ce cheminement, où les sens et la raison sont mis à l'épreuve.

L'amour divin est le moteur de cette ascension spirituelle. La "Nuit obscure" est en réalité une étape de purification où l'amour de Dieu brûle les imperfections de l'âme pour la rendre digne de sa présence. Cette purification passe par le détachement des biens terrestres, la mortification des sens et l'abandon total à la volonté divine.

Le but ultime de ce voyage spirituel est l'union mystique avec Dieu. Jean de la Croix utilise un langage symbolique et poétique pour décrire cet état d'extase et de communion totale avec le divin. L'âme, purifiée par la nuit et embrasée par l'amour, atteint un état de plénitude et de connaissance transcendante.